Phương pháp khử trùng trong cấy giống vi sinh

I. KHỬ TRÙNG BẰNG HƠI NÓNG ƯỚT

1. Đun sôi trong nước

Được sử dụng khi cần khử trùng nhanh các dụng cụ: kim tiêm, dao, kéo, kẹp, cốc .... Cách tiến hành như sau:

- Dùng nước sạch đổ ngập dụng cụ

- Đun sôi từ 10 phút đến 1giờ

- Đun cách thủy ở nhiệt độ thấp (phương pháp khử trùng Pasteur)

Dùng để khử trùng nhanh các thực phẩm dễ biến tính ở nhiệt độ cao. Cách tiến hành như sau:

Đun nóng môi trường lên 65 – 800C trong 15 – 30 phút, rồi làm nguội ngay. Phương pháp này chỉ có tác dụng ức chế VSV không có bào tử

2. Hấp cách quãng 1000C (phương pháp Tyndal)

Dùng để khử trùng một số loại môi trường nuôi cấy men bánh mì, men gia súc, mốc làm nước chấm....Cách khử trùng như sau:

- Hấp trong trường ở 1000C từ 30 – 40 phút.

- Lấy ra và đặt vào tủ ấm 24 giờ để cho bào tử vi khuẩn phát triển

- Hấp môi trường lần thứ hai ở 1000C trong 30 – 40 phút tiêu diệt các bào tử vừa nẩy mầm.

- Lặp lại quá trình này 3 – 4 lần

Kết quả:

- Môi trường vừa được khử trùng vừa được đảm bảo không thay đổi chất lượng.

3. Khử trùng bằng hơi nước bão hòa áp suất cao (nồi hấp Autoclave)

Được thực hiện trong nồi hấp vô trùng ở áp suất cao. Là thiết bị làm bằng kim loại có tính chịu nhiệt cao có khả năng tự động điều chỉnh nhiệt độ và thời gian.

Hơi nước bão hòa áp suất cao

a. Nguyên tắc hoạt động

Làm tăng nhiệt để khử trùng các vật bằng hơi nước dưới áp suất lớn hơn áp suất khí quyển. Khi áp suất tăng làm nhiệt độ tăng nhờ hệ thống van rất chặt chẽ.

Áp suất (atm)	Nhiệt độ (0C)
0	100
0,5	112
1,0	121
1,5	128
2,0	134

Bảng Mối quan hệ giữa áp suất và nhiệt độ của nồi hấp Autoclave

Thông thường khử trùng ở 1210C và duy trì trong thời gian 20 phút

b. Cách sử dụng Autoclave được thực hiện theo trình tự như sau:

- Chuẩn bị các dụng cụ chứa môi trường cần khử trùng

- Cho 3 lít nước cất vào nồi hấp rồi kiểm tra mức nước cho phù hợp

- Lần lượt đưa các dụng cụ, môi trường cần hấp vào bên trong nồi.

- Đóng chặt nồi hấp.

- Điều chỉnh kim đồng hồ thời gian và áp suất về vị trí mong muốn.

- Cắm phích điện

- Bật công tắc khử trùng nồi hấp để tiến hành hấp.

- Khi kết thúc quá trình hấp, nồi sẽ báo hiệu bằng còi.

- Gạt công tắc khử trùng về vị trí “dry”

- Chờ kim đồng hồ áp suất trở về 0 mới mở van xả khí

- Mở nắp nồi lấy dụng cụ và môi trường ra

- Rút phích điện

- Ghi nhãn ngày - tháng – năm vào dụng cụ sau khi khử trùng.

Chú ý: Để đảm bảo an toàn và hiệu quả của việc khử trùng, người thực hiện cần phải:

+ Chấp hành đúng quy chế vận hành các thiết bị áp lực cao

+ Kiểm tra lại nồi hấp trước khi sử dụng

+ Thực hiện đúng quy trình hướng dẫn

+ Tránh cung cấp điện đột ngột (vỡ dụng cụ và nguyên liệu, gây nổ nguy hiểm)

+ Trực tiếp theo dõi quá trình khử trùng cho đến khi kết thúc và ngắt điện

+ Luôn kiểm tra chất lượng đồng hồ áp kế và van an toàn

+ Không sử dụng van an toàn thường xuyên để xả hơi nước.

Tóm lại, phương pháp khử trùng bằng hơi nước bão hòa ở áp suất cao là phương pháp phổ biến và hiệu quả nhất trong các phương pháp khử trùng nhờ khả năng tiêu diệt các tế bào sinh dưỡng lẫn bào tử của vi sinh vật.Tuy nhiên, tùy từng loại môi trường khác nhau sẽ có những điều kiện khử trùng khác nhau

Đối với môi trường chứa các chất dễ biến tính (sữa, các đường)

- Đối với môi trường chứa sữa: không được khử trùng trên 1000C vì ở nhiệt độ cao sữa dễ bị biến tính. Do đó, đối với loại môi trường này, ta tách ra làm 2 phần: sữa tiến hành thanh trùng Pasteur, còn các thành phần khác được khử trùng trong autoclave. Sau đó, hòa trộn 2 thành phần đó với nhau.

- Đối với một số môi trường chứa một số chất dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao như urea thì nếu chúng ta tự pha chế thì chia ra 2 phần để khử trùng còn nếu môi trường tổng hợp thì ta khử trùng bằng cách sử dụng màng lọc có kích thước lỗ nhỏ (0,45 μm) để lọc khử trùng.

Môi trường thông thường

Tiến hành khử trùng bình thường với các điều kiện thời gian và nhiệt độ được khuyến cáo cho từng loại môi trường.

II. KHỬ TRÙNG BẰNG SỨC NÓNG NHIỆT

1 Tủ sấy

Được thực hiện trong tủ sấy, cách tiến hành trình tự như sau:

- Đặt các dụng cụ đã được bao gói vào tủ sấy

- Bật công tắc tủ hoạt động

- Điều chỉnh thời gian và nhiệt độ thích hợp (1600C/2 giờ hoặc 1800C/30 phút)

- Tắt tủ sấy, để nguội tới 50 - 600C rồi mở tủ lấy dụng cụ ra.

Lưu ý:

+ Tránh mở tủ lấy dụng cụ khi nhiệt độ tủ còn cao (dụng cụ thủy tinh dễ vỡ)

+ Các dụng cụ sau khi sấy mà giấy bao có màu hơi vàng là đạt yêu cầu. Nếu giấy bao có màu nâu chứng tỏ nhiệt độ khử trùng cao làm bông và giấy biến thành gondron (hợp chất có tính sát trùng) thì không thể sử dụng dụng cụ này để nuôi cấy VSV được.

2 Lửa nóng đỏ

Dùng để khử trùng que cấy, ống hút, đầu ống nghiệm, miệng bình tam giác sau khi lấy nút bông ra. Cách khử trùng như sau:

- Hơ dụng cụ trên ngọn lửa đèn cồn, đưa qua đưa lại đến 3 – 4 lần. Với các dây mayxo ở đầu que cấy phải nung cho thật đỏ hết chiều dài dây cấy.

- Đợi dụng cụ nguội mới được sử dụng để tránh vỡ và vi khuẩn không bị tiêu diệt khi lấy giống.

III. LỌC VÔ TRÙNG

Phương pháp đơn giản nhất là dùng các màng lọc Millipore hoặc dùng các phễu lọc thủy tinh xốp số 5. Một số loại màng lọc vô trùng của hàng Millipore. Đây là loại màng lọc đã được khử trùng bằng chiếu xạ và chỉ dùng 1 lần.

Phương pháp sử dụng màng lọc Millipore: hãng Millipore cung cấp màng lọc và giá đỡ bằng nhựa hịu nhiệt. Dưới đây mô tả màng lọc loại Millipore Swinex có đường kính 25mm. Bộ lọc gồm có giá đỡ bằng loại nhựa chịu nhiệt gồm nắp và đế, vòng cao su và màng lọc. Đặt màng lọc (có kích thước lỗ 0,25µm) trên đế, đặt vòng cao su lên và vặn chặt nắp vào đế. Gói toàn bộ bộ lọc vào trong một tờ giấy nhôm và khử trùng trong autoclave ở 1210C trong 15-20 phút. Đồng thời cũng hấp vô trùng một bình huỷ tinh để hứng dịch lọc. Dùng ống tiêm hút dịch lọc và bơm qua bộ lọc.